জাভাস্ক্রিপ্ট বর্তমানে আপনার ব্রাউজার নিষ্ক্রিয় করা হয়েছে।জাভাস্ক্রিপ্ট অক্ষম করা হলে, এই ওয়েবসাইটের কিছু ফাংশন কাজ করবে না।
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * এই লেখকদের এই কাজের কিছু অন্তর্দৃষ্টি রয়েছে সমান অবদানের পটভূমি: হায়ালুরোনিক অ্যাসিড (HA) হল একটি প্রাকৃতিকভাবে সৃষ্ট পলিস্যাকারাইড যা নান্দনিক উদ্দেশ্যে ডার্মাল ফিলার তৈরিতে ব্যবহৃত হয়।যেহেতু এটি মানুষের টিস্যুতে বেশ কয়েকদিনের অর্ধ-জীবন থাকে, তাই HA-ভিত্তিক ডার্মাল ফিলারগুলি শরীরে তাদের জীবন বাড়ানোর জন্য রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত হয়।বাণিজ্যিক HA-ভিত্তিক ফিলারগুলিতে সবচেয়ে সাধারণ পরিবর্তন হল 1,4-বুটানেডিওল ডিগ্লাইসিডিল ইথার (BDDE) HA চেইনগুলিকে ক্রসলিংক করার জন্য ক্রসলিংকিং এজেন্ট হিসাবে ব্যবহার করা।অবশিষ্ট বা অপ্রতিক্রিয়াবিহীন BDDE <2 অংশ প্রতি মিলিয়নে (ppm) অ-বিষাক্ত বলে বিবেচিত হয়;তাই, রোগীর নিরাপত্তা নিশ্চিত করতে চূড়ান্ত ডার্মাল ফিলারে অবশিষ্ট BDDE অবশ্যই পরিমাপ করা উচিত।উপাদান এবং পদ্ধতি: এই গবেষণাটি তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি (এলসি-এমএস) একত্রিত করে ক্ষারীয় অবস্থার অধীনে বিডিডিই এবং এইচএ-এর মধ্যে ক্রস-লিঙ্কিং প্রতিক্রিয়ার একটি উপ-পণ্য সনাক্তকরণ এবং বৈশিষ্ট্য বর্ণনা করে।ফলাফল: বিভিন্ন বিশ্লেষণের পরে, এটি পাওয়া গেছে যে HA-BDDE হাইড্রোজেলকে জীবাণুমুক্ত করতে ব্যবহৃত ক্ষারীয় অবস্থা এবং উচ্চ তাপমাত্রা এই নতুন উপ-পণ্য, "প্রপিলিন গ্লাইকল-সদৃশ" যৌগ গঠনের প্রচার করে।LC-MS বিশ্লেষণ নিশ্চিত করেছে যে বাই-প্রোডাক্টের BDDE এর মতো একই মনোইসোটোপিক ভর রয়েছে, একটি ভিন্ন ধরে রাখার সময় (tR), এবং একটি ভিন্ন UV শোষণ (λ=200 nm) মোড।বিডিডিই-এর বিপরীতে, এলসি-এমএস বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে একই পরিমাপের শর্তে, এই উপ-পণ্যের 200 এনএম-এ উচ্চতর সনাক্তকরণ হার রয়েছে।উপসংহার: এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে এই নতুন যৌগের গঠনে কোনও ইপোক্সাইড নেই।বাণিজ্যিক উদ্দেশ্যে HA-BDDE হাইড্রোজেল (HA ডার্মাল ফিলার) উৎপাদনে পাওয়া এই নতুন উপ-পণ্যের ঝুঁকি মূল্যায়ন করার জন্য আলোচনা উন্মুক্ত।কীওয়ার্ড: হায়ালুরোনিক অ্যাসিড, এইচএ ডার্মাল ফিলার, ক্রস-লিঙ্কড হায়ালুরোনিক অ্যাসিড, বিডিডিই, এলসি-এমএস বিশ্লেষণ, বিডিডিই বাই-প্রোডাক্ট।
হায়ালুরোনিক অ্যাসিড (এইচএ) ভিত্তিক ফিলারগুলি প্রসাধনী উদ্দেশ্যে ব্যবহৃত সবচেয়ে সাধারণ এবং জনপ্রিয় ডার্মাল ফিলার।1 এই ডার্মাল ফিলারটি একটি হাইড্রোজেল, সাধারণত >95% জল এবং 0.5-3% HA দ্বারা গঠিত, যা তাদের জেলের মতো গঠন দেয়।2 HA হল একটি পলিস্যাকারাইড এবং মেরুদণ্ডী প্রাণীদের বহির্মুখী ম্যাট্রিক্সের প্রধান উপাদান।উপাদানগুলির মধ্যে একটি।এতে রয়েছে (1,4)-গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড-β (1,3)-N-অ্যাসিটাইলগ্লুকোসামিন (GlcNAc) পুনরাবৃত্তিকারী ডিস্যাকারাইড ইউনিট যা গ্লাইকোসিডিক বন্ড দ্বারা সংযুক্ত।এই ডিস্যাকারাইড প্যাটার্ন সব জীবের মধ্যে একই।কিছু প্রোটিন-ভিত্তিক ফিলারের (যেমন কোলাজেন) সাথে তুলনা করে, এই বৈশিষ্ট্যটি HA একটি অত্যন্ত জৈব সামঞ্জস্যপূর্ণ অণু তৈরি করে।এই ফিলারগুলি অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্সের নির্দিষ্টতা প্রদর্শন করতে পারে যা রোগীর ইমিউন সিস্টেম দ্বারা স্বীকৃত হতে পারে।
যখন ডার্মাল ফিলার হিসাবে ব্যবহার করা হয়, তখন HA এর প্রধান সীমাবদ্ধতা হল টিস্যুগুলির মধ্যে এটির দ্রুত টার্নওভার হাইলুরোনিডেসেস নামক এনজাইমের একটি নির্দিষ্ট পরিবারের উপস্থিতির কারণে।এ পর্যন্ত, টিস্যুতে HA-এর অর্ধ-জীবন বাড়ানোর জন্য HA গঠনে বেশ কিছু রাসায়নিক পরিবর্তন বর্ণনা করা হয়েছে।3 এই পরিবর্তনগুলির বেশিরভাগই HA চেইনগুলিকে ক্রস-লিঙ্কিং করে পলিস্যাকারাইড পলিমারগুলিতে হায়ালুরোনিডেসের অ্যাক্সেস হ্রাস করার চেষ্টা করে।অতএব, HA কাঠামো এবং ক্রস-লিঙ্কিং এজেন্টের মধ্যে সেতু এবং আন্তঃআণবিক সমযোজী বন্ধনের কারণে, ক্রস-লিঙ্কযুক্ত HA হাইড্রোজেল প্রাকৃতিক HA-এর চেয়ে বেশি অ্যান্টি-এনজাইম অবক্ষয় পণ্য তৈরি করে।4-6
এখনও পর্যন্ত, ক্রসলিঙ্কযুক্ত HA তৈরিতে ব্যবহৃত রাসায়নিক ক্রসলিংকিং এজেন্টগুলির মধ্যে রয়েছে মেথাক্রাইলামাইড, 7 হাইড্রাইজাইড, 8 কার্বোডাইমাইড, 9 ডিভিনাইল সালফোন, 1,4-বুটানেডিওল ডিগ্লাইসিডিল ইথার (BDDE) এবং পলি (ইথিলিন গ্লাইকোল) ডিগ্লাইসিডিল ইথার।10,11 BDDE বর্তমানে সর্বাধিক ব্যবহৃত ক্রসলিংকিং এজেন্ট।যদিও এই ধরণের হাইড্রোজেলগুলি কয়েক দশক ধরে নিরাপদ বলে প্রমাণিত হয়েছে, ক্রসলিংকিং এজেন্টগুলি ব্যবহৃত প্রতিক্রিয়াশীল বিকারক যা সাইটোটক্সিক এবং কিছু ক্ষেত্রে মিউটজেনিক হতে পারে।12 অতএব, চূড়ান্ত হাইড্রোজেলে তাদের অবশিষ্ট উপাদান অবশ্যই উচ্চ হতে হবে।BDDE নিরাপদ বলে বিবেচিত হয় যখন অবশিষ্ট ঘনত্ব প্রতি মিলিয়ন (পিপিএম) 2 অংশের কম হয়।4
কম-অবশিষ্ট বিডিডিই ঘনত্ব, ক্রস-লিঙ্কিং ডিগ্রি এবং এইচএ হাইড্রোজেলে প্রতিস্থাপনের অবস্থান সনাক্ত করার বিভিন্ন পদ্ধতি রয়েছে, যেমন গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফি, ভর স্পেকট্রোমেট্রি (এমএস), নিউক্লিয়ার ম্যাগনেটিক রেজোন্যান্স (এনএমআর) ফ্লুরোসেন্স পরিমাপ পদ্ধতি, এবং সাইজ এক্সক্লুশন ক্রোমাটোগ্রাফি। ডায়োড অ্যারে যুগল উচ্চ কর্মক্ষমতা লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (HPLC)।13-17 এই গবেষণাটি ক্ষারীয় অবস্থার অধীনে BDDE এবং HA এর প্রতিক্রিয়া দ্বারা উত্পাদিত চূড়ান্ত ক্রস-লিঙ্কড HA হাইড্রোজেলে একটি উপ-পণ্য সনাক্তকরণ এবং বৈশিষ্ট্য বর্ণনা করে।এইচপিএলসি এবং তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি (এলসি-এমএস বিশ্লেষণ)।যেহেতু বিডিডিই-এর এই উপ-পণ্যের বিষাক্ততা অজানা, তাই আমরা সুপারিশ করছি যে এটির অবশিষ্টাংশের পরিমাণ নির্ধারণ করা উচিত চূড়ান্ত পণ্যে সাধারণত BDDE-তে সম্পাদিত পদ্ধতির অনুরূপভাবে।
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) এর প্রাপ্ত সোডিয়াম লবণের আণবিক ওজন ~1,368,000 Da (লরেন্ট পদ্ধতি) 18 এবং একটি অন্তর্নিহিত সান্দ্রতা 2.20 m3/kg।ক্রসলিংকিং প্রতিক্রিয়ার জন্য, BDDE (≥95%) Sigma-Aldrich Co. (সেন্ট লুইস, MO, USA) থেকে কেনা হয়েছিল।পিএইচ 7.4 সহ ফসফেট বাফার স্যালাইন সিগমা-অলড্রিচ কোম্পানি থেকে কেনা হয়েছিল।এলসি-এমএস বিশ্লেষণে ব্যবহৃত সমস্ত দ্রাবক, অ্যাসিটোনিট্রিল এবং জল এইচপিএলসি গ্রেড মানের থেকে কেনা হয়েছিল।ফরমিক অ্যাসিড (98%) বিকারক গ্রেড হিসাবে কেনা হয়।
সমস্ত পরীক্ষাগুলি একটি UPLC অ্যাক্যুইটি সিস্টেমে (ওয়াটারস, মিলফোর্ড, এমএ, ইউএসএ) সম্পাদিত হয়েছিল এবং একটি এপিআই 3000 ট্রিপল কোয়াড্রপোল ভর স্পেকট্রোমিটারের সাথে সংযুক্ত ছিল যা একটি ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নাইজেশন উত্স (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) দিয়ে সজ্জিত ছিল।
1% ক্ষার (সোডিয়াম হাইড্রোক্সাইড, NaOH) এর উপস্থিতিতে 10% (w/w) সোডিয়াম হায়ালুরোনেট (NaHA) দ্রবণে 198 mg BDDE যোগ করে ক্রস-লিঙ্কড HA হাইড্রোজেলগুলির সংশ্লেষণ শুরু হয়েছিল।প্রতিক্রিয়া মিশ্রণে চূড়ান্ত BDDE ঘনত্ব ছিল 9.9 mg/mL (0.049 mM)।তারপর, প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত এবং একজাতকরণ করা হয়েছিল এবং 4 ঘন্টার জন্য 45 ডিগ্রি সেলসিয়াসে এগিয়ে যাওয়ার অনুমতি দেওয়া হয়েছিল।19 বিক্রিয়ার pH ~12 এ বজায় রাখা হয়।
তারপরে, প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি জল দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং চূড়ান্ত HA-BDDE হাইড্রোজেলকে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং PBS বাফার দিয়ে মিশ্রিত করা হয়েছিল 10 থেকে 25 mg/mL এর HA ঘনত্ব এবং 7.4 এর চূড়ান্ত pH অর্জনের জন্য।উত্পাদিত ক্রস-লিঙ্কযুক্ত HA হাইড্রোজেলগুলিকে জীবাণুমুক্ত করার জন্য, এই সমস্ত হাইড্রোজেলগুলি অটোক্লেভ করা হয় (20 মিনিটের জন্য 120 ডিগ্রি সেলসিয়াস)।বিশুদ্ধ BDDE-HA হাইড্রোজেল বিশ্লেষণ না হওয়া পর্যন্ত 4°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়।
ক্রস-লিঙ্কযুক্ত HA পণ্যে উপস্থিত BDDE বিশ্লেষণ করার জন্য, একটি 240 মিলিগ্রাম নমুনা ওজন করা হয়েছিল এবং কেন্দ্রের গর্তে প্রবর্তন করা হয়েছিল (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; ভলিউম 0.5 mL) এবং ঘরের তাপমাত্রায় 10,000 rpm এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। 10 মিনিট.মোট 20 μL পুল-ডাউন তরল সংগ্রহ এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
ক্ষারীয় অবস্থার (1%, 0.1% এবং 0.01% NaOH) অধীনে BDDE মান (Sigma-Aldrich Co) বিশ্লেষণ করার জন্য, যদি নিম্নলিখিত শর্তগুলি পূরণ করা হয়, তাহলে তরল নমুনা 1:10, 1:100 বা পর্যন্ত 1:1,000,000 প্রয়োজনে, বিশ্লেষণের জন্য মিলিকিউ ডিওনাইজড জল ব্যবহার করুন।
ক্রস-লিংকিং বিক্রিয়ায় ব্যবহৃত প্রারম্ভিক উপকরণগুলির জন্য (HA 2%, H2O, 1% NaOH, এবং 0.049 mM BDDE), এই উপাদানগুলি থেকে প্রস্তুত প্রতিটি নমুনার 1 মিলি বিশ্লেষণ একই অবস্থার ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
আয়ন মানচিত্রে প্রদর্শিত শিখরগুলির নির্দিষ্টতা নির্ধারণ করতে, 100 ppb BDDE স্ট্যান্ডার্ড সলিউশনের 10 μL (Sigma-Aldrich Co) 20 μL নমুনায় যোগ করা হয়েছিল।এই ক্ষেত্রে, প্রতিটি নমুনায় স্ট্যান্ডার্ডের চূড়ান্ত ঘনত্ব হল 37 পিপিবি।
প্রথমে, 10 μL স্ট্যান্ডার্ড BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 μL MilliQ জল (ঘনত্ব 1.1 g/mL) দিয়ে পাতলা করে 11,000 mg/L (11,000 ppm) এর ঘনত্বের সাথে একটি BDDE স্টক সলিউশন প্রস্তুত করুন।একটি 110 µg/L (110 ppb) BDDE সলিউশন একটি মধ্যবর্তী স্ট্যান্ডার্ড ডিলিউশন হিসাবে প্রস্তুত করতে এই সমাধানটি ব্যবহার করুন।তারপর, 75, 50, 25, 10, এবং 1 ppb-এর কাঙ্ক্ষিত ঘনত্ব অর্জনের জন্য মধ্যবর্তী তরলকে কয়েকবার পাতলা করে স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা প্রস্তুত করতে মধ্যবর্তী BDDE স্ট্যান্ডার্ড ডাইলুয়েন্ট (110 ppb) ব্যবহার করুন।চিত্র 1 এ দেখানো হয়েছে, এটি পাওয়া গেছে যে 1.1 থেকে 110 পিপিবি পর্যন্ত বিডিডিই স্ট্যান্ডার্ড কার্ভের ভাল রৈখিকতা রয়েছে (R2>0.99)।স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখাটি চারটি স্বাধীন পরীক্ষায় পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।
চিত্র 1 বিডিডিই স্ট্যান্ডার্ড ক্রমাঙ্কন বক্ররেখা LC-MS বিশ্লেষণ দ্বারা প্রাপ্ত, যেখানে একটি ভাল পারস্পরিক সম্পর্ক পরিলক্ষিত হয় (R2>0.99)।
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি।
ক্রস-লিঙ্কড HA-এ উপস্থিত BDDE মান এবং বেস সলিউশনে BDDE মান চিহ্নিত করতে এবং পরিমাপ করার জন্য, LC-MS বিশ্লেষণ ব্যবহার করা হয়েছিল।
ক্রোমাটোগ্রাফিক বিচ্ছেদ একটি LUNA 2.5 µm C18(2)-HST কলামে (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) অর্জন করা হয়েছিল এবং বিশ্লেষণের সময় ঘরের তাপমাত্রায় (25°C) রাখা হয়েছিল।মোবাইল ফেজ এসিটোনিট্রিল (দ্রাবক A) এবং জল (দ্রাবক বি) 0.1% ফরমিক অ্যাসিড ধারণ করে।মোবাইল ফেজ গ্রেডিয়েন্ট ইলুশন দ্বারা বিলুপ্ত হয়।গ্রেডিয়েন্টটি নিম্নরূপ: 0 মিনিট, 2% এ;1 মিনিট, 2% A;6 মিনিট, 98% A;7 মিনিট, 98% A;7.1 মিনিট, 2% A;10 মিনিট, 2% A. চলমান সময় 10 মিনিট এবং ইনজেকশনের পরিমাণ 20 μL।BDDE এর ধরে রাখার সময় প্রায় 3.48 মিনিট (পরীক্ষার ভিত্তিতে 3.43 থেকে 4.14 মিনিট পর্যন্ত)।এলসি-এমএস বিশ্লেষণের জন্য মোবাইল ফেজটি 0.25 মিলি/মিনিট প্রবাহ হারে পাম্প করা হয়েছিল।
BDDE বিশ্লেষণ এবং MS দ্বারা পরিমাপ করার জন্য, UPLC সিস্টেম (জল) একটি এপিআই 3000 ট্রিপল কোয়াড্রপোল ভর স্পেকট্রোমিটার (AB SCIEX) এর সাথে একত্রিত হয় যা একটি ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নাইজেশন উত্স দিয়ে সজ্জিত, এবং বিশ্লেষণটি পজিটিভ আয়ন মোডে (ESI+) সঞ্চালিত হয়।
BDDE-তে সম্পাদিত আয়ন খণ্ড বিশ্লেষণ অনুসারে, সর্বোচ্চ তীব্রতার খণ্ডটি 129.1 Da (চিত্র 6) এর সাথে সম্পর্কিত খণ্ড হিসাবে নির্ধারিত হয়েছিল।অতএব, মাল্টি-আয়ন মনিটরিং মোডে (MIM) পরিমাণ নির্ধারণের জন্য, BDDE-এর ভর রূপান্তর (ভর-থেকে-চার্জ অনুপাত [m/z]) হল 203.3/129.1 Da।এটি LC-MS বিশ্লেষণের জন্য সম্পূর্ণ স্ক্যান (FS) মোড এবং পণ্য আয়ন স্ক্যান (PIS) মোড ব্যবহার করে।
পদ্ধতির নির্দিষ্টতা যাচাই করার জন্য, একটি ফাঁকা নমুনা (প্রাথমিক মোবাইল ফেজ) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।203.3/129.1 Da এর ভর রূপান্তর সহ ফাঁকা নমুনায় কোনও সংকেত সনাক্ত করা যায়নি।পরীক্ষার পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা সম্পর্কে, 55 পিপিবি (ক্র্যালিব্রেশন বক্ররেখার মাঝখানে) 10টি স্ট্যান্ডার্ড ইনজেকশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যার ফলে একটি অবশিষ্ট স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি (আরএসডি) <5% (ডেটা দেখানো হয়নি)।
অবশিষ্ট BDDE বিষয়বস্তু চারটি স্বতন্ত্র পরীক্ষা-নিরীক্ষার সাথে সম্পর্কিত আটটি ভিন্ন অটোক্লেভড BDDE ক্রস-লিঙ্কড HA হাইড্রোজেলে পরিমাপ করা হয়েছিল।"উপাদান এবং পদ্ধতি" বিভাগে বর্ণিত হিসাবে, বিডিডিই স্ট্যান্ডার্ড ডিলিউশনের রিগ্রেশন বক্ররেখার গড় মান দ্বারা পরিমাপ নির্ণয় করা হয়, যা 203.3/129.1 Da-এর BDDE ভর স্থানান্তরে সনাক্ত করা অনন্য শিখরের সাথে মিলে যায়। সময় 3.43 থেকে 4.14 মিনিট অপেক্ষা করছে না।চিত্র 2 10 ppb BDDE রেফারেন্স স্ট্যান্ডার্ডের একটি উদাহরণ ক্রোমাটোগ্রাম দেখায়।সারণি 1 আটটি ভিন্ন হাইড্রোজেলের অবশিষ্ট BDDE বিষয়বস্তুর সংক্ষিপ্তসার করে।মান পরিসীমা 1 থেকে 2.46 পিপিবি।অতএব, নমুনায় অবশিষ্ট BDDE ঘনত্ব মানুষের ব্যবহারের জন্য গ্রহণযোগ্য (<2 পিপিএম)।
চিত্র 2 10 ppb BDDE রেফারেন্স স্ট্যান্ডার্ডের আয়ন ক্রোমাটোগ্রাম (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) ট্রানজিশন 203.30/129.10 Da (ধনাত্মক MRM মোডে) এর LC-MS বিশ্লেষণ দ্বারা প্রাপ্ত।
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ;MS, ভর;m/z, ভর থেকে চার্জ অনুপাত।
দ্রষ্টব্য: নমুনা 1-8 অটোক্লেভড BDDE ক্রস-লিঙ্কড HA হাইড্রোজেল।হাইড্রোজেলে বিডিডিই-এর অবশিষ্ট পরিমাণ এবং বিডিডিই ধারণ সময় সর্বোচ্চ।অবশেষে, বিভিন্ন ধরে রাখার সময় সহ নতুন শিখরগুলির অস্তিত্বও রিপোর্ট করা হয়েছে।
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, হায়ালুরোনিক অ্যাসিড;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ;tR, ধরে রাখার সময়;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;RRT, আপেক্ষিক ধরে রাখার সময়।
আশ্চর্যজনকভাবে, এলসি-এমএস আয়ন ক্রোমাটোগ্রামের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে সমস্ত অটোক্লেভড ক্রস-লিঙ্কযুক্ত এইচএ হাইড্রোজেল নমুনার ভিত্তিতে বিশ্লেষণ করা হয়েছে, 2.73 থেকে 3.29 মিনিটের সংক্ষিপ্ত ধরে রাখার সময় একটি অতিরিক্ত শিখর ছিল।উদাহরণস্বরূপ, চিত্র 3 একটি ক্রস-লিঙ্কযুক্ত HA নমুনার আয়ন ক্রোমাটোগ্রাম দেখায়, যেখানে প্রায় 2.71 মিনিটের একটি ভিন্ন ধরে রাখার সময়ে একটি অতিরিক্ত শিখর উপস্থিত হয়।নতুন পর্যবেক্ষিত শিখর এবং বিডিডিই থেকে শিখর মধ্যে পর্যবেক্ষিত আপেক্ষিক ধরে রাখার সময় (আরআরটি) 0.79 (সারণী 1) পাওয়া গেছে।যেহেতু আমরা জানি যে LC-MS বিশ্লেষণে ব্যবহৃত C18 কলামে নতুন পর্যবেক্ষিত শিখরটি কম ধরে রাখা হয়েছে, তাই নতুন শিখরটি BDDE এর চেয়ে বেশি মেরু যৌগের সাথে মিলে যেতে পারে।
চিত্র 3 LC-MS (MRM ভর রূপান্তর 203.3/129.0 Da) দ্বারা প্রাপ্ত ক্রস-লিঙ্কড HA হাইড্রোজেল নমুনার আয়ন ক্রোমাটোগ্রাম।
সংক্ষিপ্ত রূপ: HA, hyaluronic অ্যাসিড;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ;RRT, আপেক্ষিক ধরে রাখার সময়;tR, ধরে রাখার সময়।
পর্যবেক্ষিত নতুন শিখরগুলি মূলত ব্যবহৃত কাঁচামালগুলিতে উপস্থিত দূষক হতে পারে এমন সম্ভাবনাকে বাতিল করার জন্য, এই কাঁচামালগুলিও একই LC-MS বিশ্লেষণ পদ্ধতি ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।বিশ্লেষিত প্রারম্ভিক উপকরণগুলির মধ্যে রয়েছে জল, 2% NaHA জলে, 1% NaOH জলে, এবং ক্রস-লিঙ্কিং বিক্রিয়ায় ব্যবহৃত একই ঘনত্বে BDDE।ব্যবহৃত প্রারম্ভিক উপাদানের আয়ন ক্রোমাটোগ্রাম কোনো যৌগ বা শিখর দেখায়নি, এবং এর ধারণ সময় পর্যবেক্ষণ করা নতুন শিখরের সাথে মিলে যায়।এই সত্যটি এই ধারণাটিকে বাতিল করে দেয় যে কেবলমাত্র শুরুর উপাদানটিতে এমন কোনও যৌগ বা পদার্থ থাকতে পারে যা বিশ্লেষণ পদ্ধতিতে হস্তক্ষেপ করতে পারে, তবে অন্যান্য পরীক্ষাগার পণ্যগুলির সাথে সম্ভাব্য ক্রস-দূষণের কোনও চিহ্ন নেই।BDDE এবং নতুন শিখরগুলির LC-MS বিশ্লেষণের পরে প্রাপ্ত ঘনত্বের মানগুলি সারণি 2 (নমুনা 1-4) এবং চিত্র 4 এ আয়ন ক্রোমাটোগ্রামে দেখানো হয়েছে।
দ্রষ্টব্য: নমুনা 1-4 অটোক্লেভড BDDE ক্রস-লিঙ্কড HA হাইড্রোজেল তৈরি করতে ব্যবহৃত কাঁচামালের সাথে মিলে যায়।এই নমুনা অটোক্লেভ করা ছিল না.
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, হায়ালুরোনিক অ্যাসিড;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ।
চিত্র 4 HA এবং BDDE এর ক্রস-লিঙ্কিং প্রতিক্রিয়ায় ব্যবহৃত কাঁচামালের একটি নমুনার LC-MS ক্রোমাটোগ্রামের সাথে মিলে যায়।
দ্রষ্টব্য: এই সমস্ত একই ঘনত্ব এবং অনুপাতের সাথে পরিমাপ করা হয় যা ক্রস-লিঙ্কিং প্রতিক্রিয়া চালাতে ব্যবহৃত হয়।ক্রোমাটোগ্রাম দ্বারা বিশ্লেষণ করা কাঁচামালের সংখ্যাগুলি এর সাথে মিলে যায়: (1) জল, (2) 2% HA জলীয় দ্রবণ, (3) 1% NaOH জলীয় দ্রবণ৷203.30/129.10 Da (ধনাত্মক MRM মোডে) ভর রূপান্তরের জন্য LC-MS বিশ্লেষণ করা হয়।
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, হায়ালুরোনিক অ্যাসিড;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ।
যে পরিস্থিতিগুলি নতুন শিখর গঠনের দিকে পরিচালিত করেছিল তা অধ্যয়ন করা হয়েছিল।ক্রস-লিঙ্কযুক্ত HA হাইড্রোজেল তৈরি করতে ব্যবহৃত প্রতিক্রিয়া শর্তগুলি কীভাবে বিডিডিই ক্রস-লিঙ্কিং এজেন্টের প্রতিক্রিয়াকে প্রভাবিত করে তা অধ্যয়ন করার জন্য, নতুন শিখর (সম্ভাব্য উপ-পণ্য) গঠনের দিকে পরিচালিত করে, বিভিন্ন পরিমাপ করা হয়েছিল।এই সংকল্পগুলিতে, আমরা চূড়ান্ত বিডিডিই ক্রসলিঙ্কার অধ্যয়ন ও বিশ্লেষণ করেছি, যেটিকে জলীয় মাধ্যমে বা অটোক্লেভিং ছাড়াই NaOH (0%, 1%, 0.1% এবং 0.01%) এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল।একই অবস্থার অনুকরণ করার ব্যাকটেরিয়া পদ্ধতি ক্রস-লিঙ্কযুক্ত HA হাইড্রোজেল তৈরি করতে ব্যবহৃত পদ্ধতির মতোই।"উপাদান এবং পদ্ধতি" বিভাগে বর্ণিত হিসাবে, নমুনার ভর রূপান্তর LC-MS দ্বারা 203.30/129.10 Da এ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।বিডিডিই এবং নতুন শিখরের ঘনত্ব গণনা করা হয়েছে, এবং ফলাফলগুলি সারণি 3-এ দেখানো হয়েছে। সমাধানে NaOH-এর উপস্থিতি নির্বিশেষে (নমুনা 1-4, টেবিল 3)।অটোক্লেভড নমুনাগুলির জন্য, নতুন শিখরগুলি শুধুমাত্র দ্রবণে NaOH-এর উপস্থিতিতে সনাক্ত করা হয়, এবং শীর্ষের গঠন দ্রবণে NaOH ঘনত্বের উপর নির্ভর করে বলে মনে হয় (নমুনা 5-8, টেবিল 3) (RRT = 0.79)।চিত্র 5 একটি আয়ন ক্রোমাটোগ্রামের একটি উদাহরণ দেখায়, NAOH এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে দুটি অটোক্লেভড নমুনা দেখায়।
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ।
দ্রষ্টব্য: শীর্ষ ক্রোমাটোগ্রাম: নমুনাটি 0.1% NaOH জলীয় দ্রবণ দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং অটোক্লেভ করা হয়েছিল (20 মিনিটের জন্য 120 ডিগ্রি সেলসিয়াস)।নীচের ক্রোমাটোগ্রাম: নমুনাটি NaOH দিয়ে চিকিত্সা করা হয়নি, তবে একই পরিস্থিতিতে অটোক্লেভ করা হয়েছিল।203.30/129.10 Da (ইতিবাচক MRM মোডে) এর ভর রূপান্তর LC-MS দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ।
সমস্ত অটোক্লেভড নমুনায়, NaOH সহ বা ছাড়া, BDDE ঘনত্ব ব্যাপকভাবে হ্রাস পেয়েছে (16.6 বার পর্যন্ত) (নমুনা 5-8, টেবিল 2)।BDDE ঘনত্বের হ্রাস এই কারণে হতে পারে যে উচ্চ তাপমাত্রায়, জল একটি 1,2-ডায়ল যৌগ গঠনের জন্য BDDE-এর ইপোক্সাইড রিং খুলতে একটি ভিত্তি (নিউক্লিওফাইল) হিসাবে কাজ করতে পারে।এই যৌগের মনোইসোটোপিক গুণমান BDDE এর থেকে আলাদা এবং তাই প্রভাবিত হবে না।LC-MS 203.30/129.10 Da এর একটি ভর পরিবর্তন সনাক্ত করেছে।
অবশেষে, এই পরীক্ষাগুলি দেখায় যে নতুন শিখরগুলির প্রজন্ম BDDE, NAOH এবং অটোক্লেভিং প্রক্রিয়ার উপস্থিতির উপর নির্ভর করে, কিন্তু HA এর সাথে কিছুই করার নেই।
প্রায় 2.71 মিনিট ধরে রাখার সময়ে পাওয়া নতুন শিখরটি তখন এলসি-এমএস দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল।এই উদ্দেশ্যে, BDDE (9.9 mg/mL) একটি 1% NaOH জলীয় দ্রবণে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং অটোক্লেভ করা হয়েছিল।সারণি 4-এ, নতুন শিখরের বৈশিষ্ট্যগুলি পরিচিত BDDE রেফারেন্স পিকের সাথে তুলনা করা হয়েছে (ধারণ করার সময় প্রায় 3.47 মিনিট)।দুটি চূড়ার আয়ন বিভক্তকরণ বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে, এটি উপসংহারে পৌঁছানো যেতে পারে যে 2.72 মিনিট ধরে রাখার সময় সহ শিখরটি BDDE শিখরের মতো একই টুকরো দেখায়, তবে বিভিন্ন তীব্রতার সাথে (চিত্র 6)।2.72 মিনিটের ধরে রাখার সময় (PIS) এর সাথে সম্পর্কিত শিখরের জন্য, 147 Da ভরে খণ্ডিত হওয়ার পরে আরও তীব্র শিখর পরিলক্ষিত হয়েছিল।এই সংকল্পে ব্যবহৃত BDDE ঘনত্বে (9.9 mg/mL), অতিবেগুনী বর্ণালীতে বিভিন্ন শোষণ মোড (UV, λ=200 nm) ক্রোমাটোগ্রাফিক বিচ্ছেদ (চিত্র 7) পরেও পরিলক্ষিত হয়েছিল।2.71 মিনিট ধরে রাখার সময় সহ শিখরটি এখনও 200 এনএম-এ দৃশ্যমান, যখন একই অবস্থার অধীনে ক্রোমাটোগ্রামে বিডিডিই শিখরটি পর্যবেক্ষণ করা যায় না।
সারণি 4 প্রায় 2.71 মিনিট ধরে রাখার সময় সহ নতুন শিখরটির বৈশিষ্ট্যযুক্ত ফলাফল এবং 3.47 মিনিট ধরে রাখার সময় সহ BDDE শিখর
দ্রষ্টব্য: এই ফলাফলগুলি পেতে, এলসি-এমএস এবং এইচপিএলসি বিশ্লেষণগুলি (এমআরএম এবং পিআইএস) দুটি শিখরে সম্পাদিত হয়েছিল।HPLC বিশ্লেষণের জন্য, 200 এনএম তরঙ্গদৈর্ঘ্য সহ UV সনাক্তকরণ ব্যবহার করা হয়।
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HPLC, উচ্চ কর্মক্ষমতা তরল ক্রোমাটোগ্রাফি;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ;m/z, ভর থেকে চার্জ অনুপাত;পিআইএস, পণ্য আয়ন স্ক্যানিং;অতিবেগুনি আলো, অতিবেগুনি আলো।
দ্রষ্টব্য: ভর টুকরা LC-MS বিশ্লেষণ (PIS) দ্বারা প্রাপ্ত করা হয়.শীর্ষ ক্রোমাটোগ্রাম: বিডিডিই স্ট্যান্ডার্ড নমুনা খণ্ডের ভর বর্ণালী।নীচের ক্রোমাটোগ্রাম: নতুন শিখরের ভর বর্ণালী সনাক্ত করা হয়েছে (BDDE পিকের সাথে যুক্ত RRT হল 0.79)।BDDE 1% NaOH দ্রবণে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল এবং অটোক্লেভ করা হয়েছিল।
সংক্ষিপ্ত রূপ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি;এমআরএম, একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ;পিআইএস, পণ্য আয়ন স্ক্যান;RRT, আপেক্ষিক ধরে রাখার সময়।
চিত্র 7 203.30 Da পূর্ববর্তী আয়নের আয়ন ক্রোমাটোগ্রাম, এবং (A) 2.71 মিনিট ধরে রাখার সময় সহ নতুন শিখর এবং (B) 200 nm এ 3.46 মিনিটে BDDE রেফারেন্স স্ট্যান্ডার্ড পিকের UV সনাক্তকরণ।
উত্পাদিত সমস্ত ক্রস-লিঙ্কযুক্ত HA হাইড্রোজেলগুলিতে, এটি লক্ষ্য করা গেছে যে LC-MS পরিমাপের পরে অবশিষ্ট BDDE ঘনত্ব ছিল <2 পিপিএম, তবে বিশ্লেষণে একটি নতুন অজানা শিখর উপস্থিত হয়েছিল।এই নতুন শিখর BDDE মান পণ্যের সাথে মেলে না।বিডিডিই স্ট্যান্ডার্ড পণ্যটিও ইতিবাচক এমআরএম মোডে একই মানের রূপান্তর (MRM রূপান্তর 203.30/129.10 Da) বিশ্লেষণের মধ্য দিয়ে গেছে।সাধারণত, হাইড্রোজেলে বিডিডিই সনাক্ত করতে সীমা পরীক্ষা হিসাবে ক্রোমাটোগ্রাফির মতো অন্যান্য বিশ্লেষণাত্মক পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়, তবে সর্বাধিক সনাক্তকরণ সীমা (LOD) 2 পিপিএম-এর চেয়ে সামান্য কম।অন্যদিকে, এখনও পর্যন্ত, NMR এবং MS ক্রস-লিঙ্কযুক্ত HA পণ্যগুলির চিনি ইউনিটের অংশগুলিতে ক্রস-লিঙ্কিং এবং/অথবা HA-এর পরিবর্তনের মাত্রা চিহ্নিত করতে ব্যবহৃত হয়েছে।এই কৌশলগুলির উদ্দেশ্য কখনই এই নিবন্ধে বর্ণনা করার মতো কম ঘনত্বে অবশিষ্ট BDDE সনাক্তকরণের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়নি (আমাদের LC-MS পদ্ধতির LOD = 10 ppb)।
পোস্টের সময়: সেপ্টেম্বর-০১-২০২১